背景・目的

　不要になって廃棄される多量のプラスチック製品は、環境汚染源として大きな社会問題になっており、プラスチック廃棄物をリサイクルする技術と、環境と調和する新しいタイプのプラスチックとしての生分解性高分子素材の開発が強く要望されている。我々はこれまでに道内天然ガス採掘土壌から有機溶媒・高温耐性菌Bacillussp.数種を新規に単離している。本研究ではこれらの菌からPHB合成酵素遺伝子をクローニングし、固定化菌体および固定化酵素を用いたバイオリアクターを構築、生分解性プラスチックを連続的に合成することを目的としている。

内容・方法

　道内天然ガス土壌から新規に単離した有機溶媒高温耐性菌Bacillussp.およびRalstnia eutrophaを用い、固定化菌体及び固定化酵素によって生分解性プラスチック合成バイオリアクターを構築する。
「方法」
（１）PHB合成酵素遺伝子のショットガンクローニング：ゲノムDNAの部分消化によってライブラリーを作成し、これをPHB（−）株あるいは大腸菌に導入する。PHB（＋）の形質転換体を抽出し、PHB合成酵素（Bacillussp.については報告されていないが多分オペロンを形成している）を単離する。
（２）モノマーの調製：Ralstnia eutropha由来phbAB遺伝子を大腸菌に導入し、菌体内にモノマーを蓄積するような系を構築する。またモノマー合成酵素を単離し、in vitroでモノマー合成を行う。
（３）モノマーの重合：PHB合成酵素遺伝子を大腸菌内で大量発現させ、合成酵素遺伝子を調製する。
（４）in vivoあるいはin vitroで調製したモノマーと重合酵素を用い、in vitroでPHB合成を行う。

結果・成果

（１）PHB合成菌の選択：平成８年度に勇払天然ガス採掘土壌より単離したBacillussp.3株におけるPHB生産能の比較を行い、INT005株が最も高いPHB生産能を有していることを確認した。INT005株におけるPHB含量は35wt％であり、Ralstniaと遜色のないPHB生産性を有していることがわかった。
（２）PHB合成酵素遺伝子のクローニング：Bacillussp.INT005株にゲノムDNAを定法によって抽出し、ゲノムライブラリーを作成した。現在PHB合成菌のスクリーニングを行っている。
（３）モノマーの調製：RalstniaのゲノムDNAを定法によって抽出し、PCRによってphbA、B遺伝子を増幅した。これを高発現ベクターに組み込み、大腸菌に導入した。遺伝子の発現を確認したがモノマー蓄積については確認されなかった。またモノマー合成酵素を精製し、invitroにおけるモノマー合成についても検討を行った。in vitroにおけるモノマーの合成に成功した。
（４）Ralstnia由来PHB合成酵素遺伝子の調製：RalstniaのゲノムDNAを定法によって抽出し、PCRによってphbC遺伝子を増幅した。これを高発現ベクターに組み込み、大腸菌に導入した。重合酵素を精製し、in vitroにおける重合を行った。また酵素を担体に酵素を固定化し、固定化担体上での重合に世界で初めて成功した。
（５）天然ガス採掘土壌からの高温耐性PHB合成菌の単離：高温耐性菌を数十株単離したが、現在のところPHB合成菌の取得には至っていない。現在引き続きスクリーニングを行っている。

今後の展望

　今後はこれらの系を組み合わせ連続合成が可能なバイオリアクターを構築する。さらに構築したバイオリアクターによって実際にPHBを合成し、生成したPHBのキャラクタリゼーションを行う。