環境と調和する新しいタイプのプラスチックとして生分解性高分子素材の開発が強く要望されている。我々はこれまでにRalstonia eutropha,Bacillus sp.からPHA合成酵素遺伝子をクローニング、固定化酵素を用いてPHAの合成に成功し、固定化により重合反応が効率化するため比活性が2倍以上になることを見出した。本研究ではモノマーを効率的に合成する酵素系を開発し、すでに合成に成功している重合系を組み合わせることによってバイオリアクターを構築、生分解性プラスチックをin vitroで連続合成することを目的とした。

内容・方法

効率的なモノマー合成系を確立し、重合系と組み合わせ固定化酵素バイオリアクターによる連続合成系を構築する。
（1） 非常に高価なCoA（モノマーのキャリアー）のリサイクルクリング。
（2） 高価なATPの再生系の構築。
（3） Pseudomonas putida由来Alk K（acyl-CoA synthase）を用いた1段階でのヒドロキシアシルCoA（重合酵素の基質）合成系の構築。
（4） Alk Kの固定化法、安定化の検討。
（5） Ralstonia eutropha由来重合酵素（Phb C）固定化、有機溶媒耐性付加の検討。
（6） 固定化ACS、Phb A、Phb Bと固定化Phb Cを用いたPHBの連続合成法の検討。
（7） Bacillus sp. INT005株由来の新規重合酵素（中鎖長モノマーユニットmclを含むPHA合成が可能）を用いたC6以上のmclモノマーユニットをもつPHAの合成。

結果・成果

（1） Ralstonia eutrophaのモノマー、ポリマー合成酵素を用いたin vitro PHB合成系にてCoAのリサイクルに成功した：Phb A関与の2Acetyl-CoA→Acetoacetyl-CoAで生じるCoA-SHとPhb C関与のHB-CoA→PHBで生じるCoA-SHを初期段階のACS（acetyl-CoA synthase）関与のAcetate＋CoA→Acetyl-CoAで使用されるCoA源としてリサイクルできた。
（2） Ralstonia eutrophaのモノマー、ポリマー酵素を用いたin vitro PHB合成系にてポリリン酸を用いたATP再生系の構築に成功した：Acetate＋CoA→Acetyl-CoAにカップリングするATP→AMP＋PPiの反応にADK（adenyl kinase）とPPK（polyphosphate kinase）を用いてポリリン酸をリン酸源としてATP再生を可能とした。
（3） Pseudomonas putida由来Alk KをEscherichia coliで発現させ、精製した。グリセロール20％、-20℃で保存可能。
（4） 固定化にはキトパールBCW-2603が最適。Butanoateを基質に繰り返し使用実験を行い10回目で15％程度の活性減少であった。
（5） Ralstonia eutropha由来重合酵素は、コハク酸−四ホウ酸ナトリウム緩衝液（pH7）とPEG20000で凍結乾燥し固定化した場合、10〜20％アセトン溶液中でPHB合成能を示した。
（6） Ralstonia eutrophaのモノマー、ポリマー合成酵素を固定化し、CoA、NADPH、ATPのリサイクル系と組み合わせて連続合成を行った。NADPHは、反応開始から140分で約13回、48時間で約23回リサイクルしていた。しかし、ポリマー化が進むにつれて固定化担体上のPhb Cの剥離がおこること、モノマー合成の初期段階が律速になって反応が進まなくなることなどが判明した。
（7） 道内天然ガス採掘土壌由来Bacillus sp.INT005株のPHA合成酵素はPha C以外にPha Sを合成に必要とする新規の遺伝子であった。

今後の展開
（1） 固定化Alk K、Pha Cによる2段階反応でのPHA合成の確立。
（2） アモルファス状態でPHAを抽出し、最低量のクロロホルムで結晶化させる方法の検討。
（3） 重合酵素の有機溶媒耐性をさらに強化させるとともに、シート状膜への重合酵素の固定化。
（4） 磁性担体への固定化、基質認識結合位と重合部位を別にした複合酵素、等の開発。
（5） 重合度の増加に伴い固定化された酵素が固定化担体から剥離することを防止する方法の開発。
（6） パイロット生産のためのスケールアップ基礎データの収集。