背景・目的

卵黄前駆蛋白であるビテロゲニン（Vg)はエストロゲン(E２)がエストロゲンリセプター(ER)に結合して肝臓で合成される蛋白である。また、未成熟の雄の肝臓でもE２によりVgの遺伝子が発現してくることは既に知られている。そこで、どのような構造のステロイドがERに結合でき、遺伝子発現を起すのかをニジマスの培養肝臓細胞を用いてVg遺伝子の発現をマーカーにニジマスERとステロイドの構造活性相関を調べる。また、様々な内分泌撹乱物質として考えられている物質を用いてVg遺伝子の発現と構造の関係を考察する。

内容・方法

未成熟雄のニジマス肝臓の培養細胞を用いて様々なステロイドを添加し培養する。その細胞よりmRNAを抽出しニジマスVg遺伝子をプローブとしてVg遺伝子の発現をノーザンで調べ、どのステロイドがVg遺伝子を誘導し、どのステロイドがVg遺伝子を発現させないのかを詳細に調べ、その構造特性を明らかにする。その後、構造が似ている環境ホルモンごとに重ね合せ、それらの表面電化ポテンシャルを計測しどの官能基がリセプターの何処に結合しているのかを量子化学計算ソフトQUATA/CHARMmとMOPAC6.0を用いて解析する。同様に様々な環境ホルモンをニジマス肝臓の培養細胞に添加し、Vg遺伝子の誘導を起すものとそうでないものに分類する。また、これらが、細胞内でE２様化学物質に変換されてVg遺伝子の発現を誘導する可能性も示唆されるため、エライザー法を用いて細胞内でE２様物質に変換の可能性を調べ、構造化学的な解析を行う。

結果・成果

ステロイドでのVgの遺伝子発現の有無を調べた結果、遺伝子発現を起すものと、起さないものに分かれ、遺伝子発現を起すものはERを通した遺伝子発現であることが判った。 また、ほとんどのVg遺伝子を発現させるステロイドがE２に変換されていなかったため、これらステロイドはE２に変換されること無くニジマスERに直接結合するものとしないものに分かれていることが予測された。Vg遺伝子の発現を起こすほとんどのステロイドは骨格が重なり合うことが判り、且つ遺伝子発現を起すステロイドの静電ポテンシャルは分子の両端を除いてはほとんど極性が無い構造をしていた。一方、遺伝子発現を起さないステロイドの静電ポテンシャルは骨格内に極性を有する部分が存在した。このことから、ERに結合するためには先ず第一にER内のアミノ酸と水素結合が出来なければならない。第二にリセプター内の疎水性アミノ酸とファンデルワールス結合し結合が安定化することが必要であることが判った。そのため、遺伝子発現を起さないステロイドは内部骨格上に極性があり、ERとの疎水性相互作用が乱されERと結合できないことが判った。 　一方、環境ホルモンとして知られている幾つかの化学物質（ノニルフェノール、ベンゾエピン、アミトール　、アトラジン、テトラヒドロナフトール）などを用いて肝臓の培養細胞やインタクトの魚でVg遺伝子の発現を調べた結果、ノニルフェノールやベンゾエピンは高濃度の処理で確実に遺伝子発現を起こすがアミトール、アトラジンでは全く遺伝子発現を起こさないことが判った。そのため、ノニルフェノールをERとの結合解析した結果、E２とほぼ同じ箇所に入り込むことが判ったが、ステロイドの場合と異なり骨格の片側のみが水素結合し、骨格内部は疎水性相互作用で安定することが判った。

今後の展望

活性相関性を考えながら環境ホルモンとERとの結合実験をあまり行うことが出来なかったため、環境ホルモンに関しては基本骨格ごとに結合に関与するアミノ酸残基を割り出すことが出来なかった。そのため、結合が安定していられるか否かは不明なため、今後、酵母を用いたTwo-ハイブリット法でニジマスERのどのアミノ酸とどれだけの結合に関与しているのかを調べる必要がある。